МГУ–2012: Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского

Общие сведения

В 2012 г. в 19 исследовательских и 5 научно-методических отделах работали 226 научных сотрудников, в т.ч. 6 академиков и 4 члена-корреспондента РАН, 5 действительных членов государственных и общественных академий РФ, 6 членов зарубежных академий, 69 докторов и 172 кандидата наук.

 

Наука

Институт ведёт один из крупнейших биомедицинских проектов России, направленный на разработку и внедрение лекарственных препаратов, сконструированных на новом принципе: адресной доставке целевых веществ в энергетические станции клетки – митохондрии. В 2012 г. проект перешёл на принципиально новый этап – был зарегистрирован и выведен на фармацевтический рынок России первый лекарственный препарат – глазные капли Визомитин против возрастных офтальмологических заболеваний. Действующим веществом этих капель является митохондриальный антиоксидант SkQ1. Визомитин не имеет аналогов за рубежом.

Активно использовалось новое уникальное оборудование, приобретённое в рамках Программы развития МГУ. Налажен анализ антибактериальной активности как химических соединений, синтезированных на химическом факультете, так и природных соединений, продуцируемых почвенными микроорганизмами (предоставляются в рамках научного сотрудничества с институтами РАМН). Разработанная система скрининга позволяет сразу выявлять мишень антибактериального препарата в клетке. Системы массового скрининга созданы и применяются для целей функциональной геномики – определения функции неизученных ранее генов. В ходе этой работы выявлен новый фермент РНК-метилтрансфераза и изучены свойства подобных метилтрансфераз. Был создан новый метод протеомики, позволяющий выявлять и анализировать недавно синтезированные белки.

В 2012 г. научно-исследовательская работа сотрудников осуществлялась по 23 госбюджетным темам, относящимся к 5 приоритетным научным направлениям, утверждённым Учёным советом 26 дек. 2011 г.: «Структура и функции биологических макромолекул и макромолекулярных комплексов. Биокатализ», «Структура и функция биологических мембран. Биоэнергетика. Фотосинтез», «Структура и функционирование клетки. Межклеточные взаимодействия», «Геномика, протеомика. Молекулярная медицина», «Математические модели в биологии».

Работа была поддержана 139 грантами РФФИ, 22 международными проектами и грантами (в т.ч. РФФИ), а также 15 государственными контрактами в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009–2013 гг.» и «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технического комплекса России на 2007–2012 гг.».

Завершены работы по 10 государственным контрактам и 46 проекту, поддержанному грантами РФФИ.

В ходе выполнения Госконтракта по теме «Создание и испытание новых митохондриально-направленных антиоксидантов» (рук. д.б.н. Б.В. Черняк), разработан метод синтеза митохондриально-направленных антиоксидантов на основе природных катионов берберина и пальматина. Показана их высокая антиоксидантная активность и эффективность при защите клеток от окислительного стресса. Показано, что новые антиоксиданты ингибируют развитие воспалительного ответа, ингибируют пролиферацию и индуцируют дифференцировку различных раковых клеток. Они ускоряют процесс заживления полнослойных кожных ран у старых мышей и у мышей с диабетом 2-го типа.

В рамках выполнения Госконтракта по теме «Создание новой системы выявления метилированных оснований рибосомной РНК, в т.ч. вызывающих устойчивость бактерий к антибиотикам, и ферментов, метилирующих основания рибосомной РНК» (рук. чл.-корр. РАН О.А. Донцова) разработана универсальная система поиска модифицированных оснований рибосомной РНК с использованием высокоточного анализа кривых плавления дуплексов, сформированных рибосомной РНК и олигонуклеотидами, несущими флуоресцентную метку. Идентифицирована последняя рРНК-метилтрансфераза YhiR E. coli. Подана заявка на патент.

В рамках выполнения Госконтракта по теме «Создание низкомолекулярных веществ ненуклеозидной природы, ингибирующих интегразу ВИЧ-1, для последующего формирования стратегии создания лекарственных препаратов на их основе (рук. д.х.н. М.Б. Готтих) синтезирован ряд производных нитробензофуразанов (НБФЗ) и нитробензофуроксанов (НБФС). Проведены исследования их ингибирующей активности, блокирования репликации ВИЧ-1 и цитотоксичности. На основании всех проведенных экспериментов установлено, что наиболее активным ингибитором является 7-бромметил-4,6-динитробензофуроксан. Разработан новый флуоресцентный метод тестирования низкомолекулярных соединений в качестве блокаторов интегразы ВИЧ-1. Метод проще и экономичнее существующих аналогов, важным достоинством которого является возможность его автоматизации. Показано, что все разработанные ингибиторы интегразы имеют другой механизм действия, чем разрешённые к клиническому применению ралтегравир и элвитегравир, и, эффективны против мутантных форм интегразы, устойчивых к ралтегравиру и элвитегравиру. Показано, что разработанные ингибиторы интегразы эффективны в отношении фермента, соответствующего интегразе из ВИЧ-1 подтипа А, который является основным подтипом этого вируса, циркулирующим на территории РФ. Подана заявка на патент.

В ходе выполнения Госконтракта по теме «Генетические факторы дифференцировки и закономерности их эволюции, сопряжённой с филогенезом животных и растений» (рук. д.б.н. В.В. Алёшин) были охарактеризованы отдельные гены и геномы растений, животных и их одноклеточных родственников, а также реконструированы изменения геномов в филогенезе. В геномах одноклеточных обнаружены гомологи генов транскрипционных факторов, протеинкиназ, фосфатаз, белков адгезии и межклеточных контактов, другие гены, гомологи которые участвуют у многоклеточных животных в регуляции пролиферации, прикрепление клеток к матриксу, к другим клеткам, миграцию в пределах зародыша, клеточную дифференцировку. Очевидно, они служили эволюционными предшественниками генетического инструментария клеточной дифференцировки и развития многоклеточных. С применением методов высокопроизводительного секвенирования получены новые экспериментальные данные по транскриптомам ряда растений. С использованием мультигенного анализа произведено уточнение элементов филогенетических деревьев животных, грибов и высших растений.

Проводились работы по двум Госконтрактам, завершившимся в 2012 г. (рук. д.б.н. А.Б. Вартапетян): 1) «Выяснение молекулярного механизма образования пептидных гормонов растений научно-образовательным центром «Физико-химическая и молекулярная биология». Удалось выяснить механизм образования пептидных гормонов растений, запускающих защитный и ростовой сигнальные пути, и идентифицировать ключевой фермент растений конвертазу, ответственный за процессинг прогормонов. До настоящего времени конвертаза растений и механизм образования пептидных гормонов растений не были известны. Полученные результаты представляют собой качественно новый уровень понимания механизмов образования пептидных гормонов растений и ферментов, участвующих в этом процессе. 2) «Включение механизма программируемой клеточной смерти у растений и животных». Полученные результаты позволили впервые установить способы, с помощью которых осуществляется включение механизма апоптоза у растений, и охарактеризовать основных участников этого процесса.

В институте работает национальный российский узел ENBnet Европейской организации по биокомпьютингу, обеспечивающий биологов и медиков России телекоммуникационным доступом к анализу структурных баз данных.

 

«Структура и функции биологических макромолекул и макромолекулярных комплексов. Биокатализ»

В отделе биокинетики (зав. д.х.н. В.Ю.К. Швядас) проанализированы таблицы экспрессии генов в образцах опухолей колоректального рака, определено положение генов белков каскада арахидоновой кислоты в модулях коэкспрессии, оценена возможность их модуляции противоопухолевыми и противовоспалительными препаратами. Получены таблицы экспрессии генов в 300 образцах ткани и проведён их сравнительный анализ с целью выделения специфических для эпендимы мозга генов – потенциальных мишеней лекарственных средств.

При помощи методов молекулярного моделирования и биоинформатики изучены взаимосвязи между структурой и функциональными свойствами ферментов семейства альфа/бета гидролаз, создана виртуальная библиотека мутантных форм липазы, разработан метод in silico оценки каталитической активности мутантных липаз и проведён компьютерный скрининг библиотеки мутантных липаз, позволивший выявить мутантные формы фермента с улучшенными каталитическими свойствами.

Показано, что направленная регуляция 2-оксоглутаратдегидрогеназы (в т.ч. предшественником её кофермента – тиамином) в эукариотических системах ведёт к существенным изменениям гомеостаза аминокислот и белков, что может быть использовано для корректировки ответа животных на стресс.

Получены экспериментальные данные по исследованию фагоцитоза частиц зимозана полиморфноядерными лейкоцитами человека при опсонизации зимозана с добавлением липидов. Исследование сульфатидов в качестве опсонинов при фагоцитозе бактерий Salmonella Typhimurium позволило установить значительное (более 150%) увеличение синтеза лейкотриенов.

В отделе биохимии животной клетки (зав. д.б.н. В.И. Муронец) продолжалось изучение фундаментальных основ механизма действия и структуры ферментов. Наибольший интерес представляют результаты изучения механизмов, обуславливающих повышенную стабильность сперматозоидного изофермента глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (ГАФДс). В норме сперматозоидная изоформа глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы (ГАФД) синтезируется только в сперматозоидах. Ранее было обнаружено, что уровень мРНК сперматозоидной ГАФД повышен в некоторых клеточных линиях меланом. Из меланомных линий Меl P и Mel Kor был выделен белковый продукт и охарактеризован с помощью масс-спектрометрического анализа. Было показано, что данный продукт представляет собой сперматозоидную форму ГАФДс. Методом иммуногистохимии показана цитоплазматическая локализация ГАФДс в меланомных клетках. Иммуноблоттинг с использованием поликлональных антител против денатурированной ГАФДс не выявил ГАФДс в 12 немеланомных опухолевых клеточных линиях. Таким образом, впервые было показано, что ГАФДс в норме синтезирующаяся только в сперматозоидах, появляется в меланомных клетках, то есть, возможно, ГАФДс может быть специфическим белковым маркером меланомы.

В отделе белков растений (зав. д.б.н. М.А. Белозерский) продолжено изучение функциональной роли протеиназ в живых организмах возможности использования их ингибиторов для защиты сельскохозяйственных растений от фитопатогенов и насекомых вредителей. Для повышения уровня экспрессии целевого гена ингибитора протеиназ BWI-1a из семян гречихи (ISP) в тканях трансгенных растений с помощью процедур молекулярного клонирования создано 8 новых векторных конструкций с геном BWI-1a (ISP), несущих в качестве энхансера вставки фрагментов гена спидроина (белка паутины паука) в прямой и обратной ориентации и разном количестве. Четыре конструкции введены в агробактериальные штаммы (A. tumefaciens pGV3810) и использованы для получения трансформированных растений табака.

Показано, что образование облигатных биотических связей с насекомыми влияет на спектр секретируемых грибами пептидаз. Выявлена связь между субстрат-специфичной активностью секретируемых пептидаз и принадлежностью грибов к определённым трофическим группам. Сравнение общей и класс-специфичной активности пептидаз, а также определение оптимумов рН этих активностей в «грибных садах», свидетельствовало об адаптивных изменениях, происходящих в спектре секретируемых соединений гриба при переходе его к мутуалистическому образу жизни. Исследованы главные пищеварительные катепсины L из личинок жуков-вредителей зерновых запасов Tenebrio molitor и Tribolium castaneum: определена их первичная структура, физико-химические и энзиматические свойства. Проведено сравнение профиля экспрессии генов пищеварительных ферментов в кишечниках личинок Т. molitor и T. castaneum на базе данных 454 пиросеквенирования и гибридизации на микрочипе, соответственно.

В отделе химии белка (зав. д.х.н. А.А. Байков) открыто новое семейство мембранных пирофосфатаз, способных одновременно переносить через мембрану ионы натрия и водорода. Построено детальное филогенетическое дерево трёх семейств мембранных пирофосфатаз, подтверждающее более древнее происхождение «натриевой» биоэнергетики по сравнению с «протонной».

Выделены и охарактеризованы две растворимые пирофосфатазы, имеющие в своем составе регуляторные нуклеотид-связывающие CBS-домены. В клетках Escherichia coli идентифицирован фермент, катализирующий изомеризацию глюкозо-6-фосфата в фруктозо-6-фосфат. В рамках договора с Институтом кристаллографии РАН проводится оптимизация условий кристаллизации нового фермента. Проведено компьютерное моделирование пространственной структуры фруктозо-1,6-бисфосфатальдолазы класса I E. coli (FbaB), на основании которого предсказано строение активного центра. Проводится работа по получению тяжелоатомных производных FbaB, необходимых для решения кристаллической структуры. Идентифицированы два белка-партнера пирофосфатазы (Ade13p и Sro9p) в лизате клеток дрожжей.

В рамках проекта по поиску антибактериальных веществ на базе структурного анализа рибосомы (рук. акад. РАН А.А. Богданов) проводилась работа, направленная на дизайн, синтез и исследование взаимодействия с рибосомой нового класса химических агентов, предназначенных для изучения механизма синтеза белка, а именно ингибиторов трансляции, действие которых направлено на Р-сайт пептидилтрансферазного центра (ПТЦ) рибосомы. В качестве таких агентов были предложены новые производные пептидо-нуклеиновых кислот (PNA), представляющие интерес и как зонды для изучения функционирования рибосомы, и как основа для создания антибиотиков нового поколения. Проведены работы по синтезу аналогов пептидил-тРНК, в структуру которых входит PNA. У таких соединений существует потенциальная возможность образовывать пептидную связь с аминоацил-тРНК, расположенной в А-сайте рибосомы, при этом возможно «заякоривание» аналога пептидил-тРНК в А-сайте.

Для определения констант связывания производных макролидов с рибосомой разрабатывался способ на основе метода поляризации флуоресценции. Способ основан на вытеснении флуоресцентно-меченного производного макролида из его комплексов с рибосомой испытуемыми соединениями. В рамках разработки метода было синтезировано флуоресцентное производное эритромицина, содержащее флуоресцентную метку BODIPY в 9-ом положении макролидного кольца, которое было использовано для определения констант связывания ряда производных макролидов с рибосомами E. coli, в частности, производных 5-О-микаминозилтилонолида (ОМТ).

Методом моделирования молекулярной динамики изучены молекулярные механизмы взаимодействий эритромицина, тилозина, 5-О-микаминозилтилонолида (ОМТ) и ряда его производных (BocGlyOMT, BocbAlaOMT, BocgAbuOMT) с бактериальными рибосомами Н. marismortui и Е.coli, что позволило предложить рациональное объяснение более высокой, чем у других производных ОМТ, ингибиторной активности BocGlyOMT в бесклеточной системе биосинтеза белка и более низкой константы связывания с рибосомами E.сoli, полученной методом поляризации флуоресценции, для этого соединения.

В отделе структуры и функции рибонуклеиновых кислот (зав. чл.-корр. РАН О.А. Донцова) cоздана система репортерных конструкций для мониторинга состояния регуляторных путей кишечной палочки. Разработан метод сравнительного анализа белков, синтезируемых рибосомами в определённый момент времени. Определена роль нуклеотидов m2G966 и m5C967 16S рРНК. Изучены особенности функционирования метилтрансферазы RsmD, идентифицирована рРНК-метилтрансфераза кишечной палочки YhiR.

Определены гены теломеразной РНК и дополнительных теломеразных компонентов термотолерантных дрожжей: Est3, Est1, разработан метод выделения белков Est3, Est2 и его N-концевого домена. Предложен новый механизм регулирования длины теломер. Показано существование специфических разрывов рядом с внутрихромосомными теломерными повторами в различных модельных организмах. Показано блокирование роста разных клеточных линий опухолевых клеток низкомолекулярным ингибитором теломеразы, предложен способ блокирования работы теломеразы на стадии сборки активного комплекса.

В лаборатории регуляции синтеза белка (зав. д.х.н. И.Н. Шатский) с помощью масс-спектрометрии обнаружен белок, который связывался высоко специфично c IRES-элементами РНК энтеровирусов, включая полиовирус, и не связывался с IRES-элементами из РНК других типов пикорнавирусов. Этим белком совершенно неожиданно оказалась глицил-тРНК синтетаза (GlyRS), то есть фермент, основная функция которого во всех живых клетках от бактерий до человека это навешивать аминокислоту глицин на глициловую тРНК. Оказалось, что специфичность связывания GlyRS с IRES-элементами РНК энтеро- и риновирусов определяется тем, что в домен V этих IRES-элементов встроена антикодоновая петля глициловой тРНК. Взаимодействие GlyRS с доменом V совершенно необходимо для активности IRES-элемента полиовируса в связывании рибосомы, то есть для белок-синтезирующей способности вирусной РНК.

 

«Структура и функция биологических мембран. Биоэнергетика. Фотосинтез»

В отделе биоэнергетики (зав. акад. РАН В.П. Скулачёв) наибольший интерес представляют результаты:

1) Нефро- и нейропротектрное действие проникающих катионов семейства SkQ связано как с их антиоксидантным действием, так и с частичным («мягким») разобщением дыхания и фосфорилирования. Исследована новая группа митохондриально направленных антиоксидантов, в которых «катионный локомотив» представлен природными проникающими катионами барберином и пальматином.

2) На основании детального сравнения оптических и магнитно-оптических свойств bd –оксидаз из кишечной палочки и из Geobacillus thermodenitrific, относящихся, соответственно, к группе «L»(long) и более многочисленной «S»(small), выявлены существенные различия между ферментами, касающиеся взаимодействия с лигандами (СО), силы экситонного взаимодействия между гемами b595 и d, что свидетельствует о разном расстоянии между ними и/или разном угле наклона плоскостей порфириновых колец.

3) Для исследования давно дискутировавшегося в литературе вопроса о функциональной значимости А- и В-цепей комплекса ФС1 в место связывания природного хинона на А- и В-цепях комплекса ФС1, выделенного из мутантного штамма цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803, не способного к синтезу собственного филохинона, внедрён искусственный хинон,2,3-дихлор-1,4-нафтохинон, потенциал которого на 400мВ выше, чем у филохинона, что блокировало дальнейший перенос электронов на железо-серный кластер. В этих условиях показано, что не работающей является именно цепь В-, поскольку на ней не регистрируется образование радикальной пары.

В отделе молекулярной энергетики микроорганизмов (зав. д.б.н. А.В. Богачёв) основное направление исследований функционирование электрон-транспортных цепей. С помощью анаэробного равновесного окислительно-восстановительного титрования показано, что изменение концентрации Na⁺ в реакционной среде не оказывают влияния на термодинамические свойства простетических групп Na⁺-транслоцирующей NADH:хинон оксидоредуктазы (Na⁺-NQR) из морской бактерии Vibrio harveyi, но значительно изменяет ЭПР-спектральные свойства радикальной пары, сформированной двумя анионными семихинонами остатков FMN, связанных с субъединицами NqrB и NqrC (FMN_NqrB и FMN_NqrC) этого фермента. Установлено, что расстояние между ковалентно связанными остатками FMN могут изменяться приблизительно на 5 Е при изменении концентрации ионов натрия. Предложена схема генерации натриевого потенциала Na⁺-NQR, основанная на окислительно-восстановительных и натрий-зависимых конформационных изменениях в этом ферменте.

Проведен геномный анализ и структурное моделирование ранее неисследованного белка UrdA (SO_4620) из бактерии Shewanella oneidensis MR-1, обладающего уроканат редуктазной ферментативной активностью, ранее не описанной в литературе, что было подтверждено биохимическим исследованием продукта клонированного и экспрессированного гена urdA. Белки, гомологичные UrdA, были обнаружены у различных бактерий (Shewanella, Fusobacterium и Clostridium, в т.ч. патогенна человека Clostridium tetani). Показано, что активность UrdA в S. oneidensis MR-1 индуцируется в анаэробных условиях в присутствии урокановой кислоты, что предоставляет клеткам UrdA-содержащих бактерий экологическую нишу, недоступную всем остальным живым организмам.

Синтезирован аналог пептида грамицидина, вызывающий разобщение дыхания и фосфорилирования на изолированных митохондриях и митохондриях в клетках и лишённый эффекта цитотоксичности. Этот пептид может рассматриваться как потенциальное лекарственное средство.

В отделе фотобиофизики (зав. акад. РАН В.А. Шувалов) с помощью фемтосекундной спектроскопии изучали влияние кристаллографической воды на перенос электрона между первичным донором Р и акцептором В_А в реакционных центрах (РЦ) пурпурных бактерий Rbа. sphaeroides и зелёных бактерий Cfx. aurantiacus при 90 К. Обнаружено замедление разделения зарядов, уменьшение амплитуды осциллирующих компонент и обеднение их спектра при высушивании РЦ Rbа. sphaeroides и Cfx. aurantiacus. Основная временная константа спада вынужденного излучения димера бактериохлорофилла Р* при 940 нм увеличивается от 1.1 пс в водосодержащих РЦ Rbа. sphaeroides до 1.9 пс в сухих плёнках РЦ Rbа. sphaeroides. В полосе поглощения аниона мономерного бактериохлорофилла В_А^– при 1020 нм в сухих плёнках РЦ Rbа. sphaeroides амплитуда когерентных осцилляций меньше в 1.8 раза для компоненты с частотой 130 см^–1 и в 2.3 раза для компоненты с частотой 32 см^–1 , чем аналогичная амплитуда для водосодержащих РЦ Rbа. sphaeroides. Измерения в аналогичной полосе РЦ Cfx. aurantiacus при 1028 нм показывают, что при высушивании этих РЦ происходит сильное уменьшение в 5–10 раз полосы поглощения В_А^– и сильное замедление в 4 раза накопления В_А^–, а амплитуда осцилляций уменьшается в 3 раза. При высушивании РЦ Rbа. sphaeroides и Cfx. aurantiacus из осцилляций кинетик при 940 и 1020–1028 нм исчезают обертона компоненты при 32 см^–1. Полученные данные могут указывать на влияние или участие воды НОН55 на перенос электрона по цепи полярных групп атомов N–Mg(P_B)–N–C–N(HisM202)–HOH55–O=(B_A), соединяющей P_B и B_A в РЦ Rbа. sphaeroides.

Исследована динамика первичного разделения зарядов в РЦ пурпурной бактерии Rba. sphaeroides и её Р870-гетеродимерных мутантов с помощью фемтосекундной спектроскопии при 293 К. В разностных спектрах поглощения обнаружено увеличение поглощения в области 1060–1130 нм, которое может принадлежать молекуле катион-радикала Р_А^delta+ в составе смешанного состояния с частичным разделением зарядов внутри димера Р*(Р_А^delta+ Р_B^delta-). Найдено, что в нативных РЦ Rba. sphaeroides это состояние формируется спустя всего 120–180 фс после возбуждения, а в РЦ гетеродимерных мутантов H(L173)L и H(M202)L – ещё быстрее. Таким образом, состояние Р*(Р_А^delta+ Р_B^delta-) образуется раньше, чем происходит перенос электрона на мономерный бактериохлорофилл В_А (за 1.1 пс). Данные эксперимента показывают, что при 20-фс возбуждении энергия электрон-колебательного волнового пакета достаточна для обратимого преодоления барьера между состояниями Р* и Р*(Р_А^delta+ Р_B^delta-) при задержке 500 фс. При 40-фс возбуждении этот эффект отсутствует и туннелирование этого барьера занимает 3 пс.

В отделе фотосинтеза и флуоресцентных методов исследовании (зав. д.ф.-м.н. А.П. Разживин) расшифрован механизм двухфотонного возбуждения светособирающих комплексов пурпурных бактерий, который обусловлен поглощением квантов света чётными экситонными компонентами верхней ветви давыдовского расщепления для кольцевого агрегата молекул бактериохлорофилла (модель Абе). Изучена эффективность переноса энергии возбуждения в гибридных системах на основе полупроводниковых нанокристаллов («квантовых точек») и различных пигмент-белковых комплексов, входящих в светособирающие антенны фотосинтетического аппарата. Определены характеристики переноса энергии возбуждения между изоэнергетичными молекулами хлорофилла в светособирающем комплексе LHCII. Дано теоретическое описание динамики возбуждений в светособирающем комплексе LHCII цианобактерий и антенном комплексе PE545 криптомонады Rhodomonas CS24. Опубликованы две критические работы о структуре и функции хлоросом зелёных бактерий на основе анализа эффективности и времён переноса энергии возбуждения.

 

«Структура и функционирование клетки. Межклеточные взаимодействия. Молекулярные механизмы клеточной дифференцировки, иммунитета и онкогенеза. Взаимодействие вирус-клетка»

В отделе биохимии вирусов растений (зав. акад. РАН И.Г. Атабеков) доведены до стадии производства иммунохроматографические тест-полоски для молекулярной диагностики пяти вирусов, вызывающих инфекции картофеля. Изучены некоторые функции гена ОРТ-6 тобамовируса: показано, что тип локализации белка OPT-6 в клетках и степень выраженности симптомов при вирусной инфекции растений, определяется С-концевым районом белка, тогда как N-концевой район белка содержит сигнал локализации в ядрышке, активность которого различна для разных тобамовирусов. Рекомбинантный белок L-ОРТ-6 вируса мозаики томата способен связывать одноцепочечную РНК и двуцепочечную РНК и ДНК. Показана возможность прямого взаимодействия белка L-ОРТ-6 с 3’-нетранслирумой областью вирусной РНК. Установлено, что активность белка 2b кукумовируса огуречной мозаики как супрессора посттранскрипционного умолкания генов определяется его эффективным взаимодействием с малыми РНК и не требует постоянной локализации белка в ядре клеток.

Научно-методический отдел хроматографического анализа (зав. д.х.н. Л.А. Баратова) участвует в решении задач сотрудников института и проводит самостоятельные исследования в совместно с другими отделами.

Впервые предложена модель М1 белка, разработанная на основании структуры полноразмерного матриксного М1 белка вируса гриппа штамм А/Puerto Rico/8/34 (подтип H1N1) в кислом растворе, имитирующем лизосомальную среду, исследованную методом малоуглового рентгеновского рассеяния. Данная модель демонстрирует структурную поляризацию молекулы с компактным NM фрагментом и слабо структурированным С-концевым доменом. Наблюдаемые структурные особенности могут объяснить способность М1 белка опосредовать множественные процессы клеточного инфицирования вследствие гибкости С-концевой области, а также неудачи при неоднократных попытках кристаллизации полноразмерного белка. Предложенная модель подтверждается рядом альтернативных методов.

Проведено изучение роли пост-трансляционной модификации гликобелков оболочечных вирусов высшими жирными кислотами (S-ацилирования) в жизненном цикле вируса. Мажорный антиген вируса гриппа гемагглютинин исследован в составе серии лабораторных реассортантов, включающих поверхностные белки (нейраминидазу и /или гемагглютинин) одного родительского штамма и внутренние белки (в частности, белки М1 и М2) другого штамма вируса. Показано, что ни нейраминидаза, ни М-белки не влияют на гетерогенность ацилирования вновь синтезированных молекул гемагглютинина в клетке остатками пальмитатов и стеаратов.

Изучены гемостатические свойства ДНК-аптамеров по четырём параметрам: тромбиновое время, протромбиновое время, АЧТВ, амидолитическая активность. Показано, что в присутствии аптамеров эти параметры удлиняются. Изучено влияние аптамеров на параметры гемостаза in vivo. Показано, что в виде полиэлектролитных комплексов с протамином ДНК-аптамеры, ингибирующие тромбин, резко увеличивают время полужизни в кровотоке. Получены ДНК-аптамеры к интерлейкину-6. С помощью проточной цитофлуориметрии показано их влияние на комплексообразование интерлейкина-6 с клеточными рецепторами.

В отделе функциональной биохимии биополимеров (зав. акад. РАН В.А. Ткачук) главным направлением исследований является выяснение молекулярных основ явлений биологической подвижности в сравнительно-эволюционном аспекте.

Для проверки высказанной ранее гипотезы о структурной организации молекулы ТМ, согласно которой молекула состоит из двух доменов разной стабильности (N-концевого и C-концевого) и нестабильного центрального участка между ними, были получены мутантные белки с точными заменами аминокислот. Используя метод дифференциальной сканирующей калориметрии, установили, что мутация D137L в молекуле тропомиозина, в отличие от G126R, стабилизирует не только центральную часть молекулы, но и другие её части, а одновременное введение обеих этих мутаций приводит к ещё более сильной стабилизации двойной α-спирали Tm.

Одной из существенных черт цитодифференцировки может быть структура сети микротрубочек в клетках, которая может зависеть либо от центросомы, либо от аппарата Гольджи. Показано, что в клетках, содержащих микротрубочковый мотор динактин, постоянно связанный с центросомой, формируется устойчивая радиальная система микротрубочек.

В плане исследований ультраструктурных изменений в клетке при стрессе, вызванном подкислением среды, продемонстрировано, прекращение образования РНП-содержащих стрессовых гранул, и утрату способности уже образованных гранул к разборке при снятии стрессового воздействия. Это не связано с нарушением транспорта по микротрубочкам, хотя закисление среды приводит к ингибированию такого транспорта.

В отделе взаимодействия вируса с клеткой (зав. чл.-корр. РАН В.И. Агол) показано, что основной причиной вызываемых вирусом повреждений клетки (цитопатитческого эффекта) может являться «борьба» между защитными механизмами клетки и противозащитными механизмами вируса, а не конкуренция за клеточные ресурсы. На модели вируса энцефаломиокардита показано, что при частичном взаимном «разоружении» клетки и вируса (выключении одного из защитных механизмов клетки и инактивации одного из противозащитных вирусных белков) полный урожай вируса образуется задолго до появления существенных патологических изменений клеток. Выдвинута гипотеза о том, что цитопатический эффект может быть проявлением модифицированной вирусом программы врожденного иммунитета. Одновременное подавление этой иммунной программы и противозащитных механизмов вируса может быть перспективной стратегией борьбы с вирусными болезнями.

В отделе электронной микроскопии (зав. д.б.н. В.Ю. Поляков) проводятся ультраструктурные исследования для сотрудников института и научные изыскания в области ультраструктурной организации клетки.

Впервые описана динамика локализации прогерина – изоформы ламина А, гиперэкспрессия которой ведёт к преждевременному старению, в ядре на различных стадиях клеточного цикла. Установлено, что мРНК прогерина может быть определена в клетках периферической крови, что может быть использовано в медицинской диагностике.

Изучена динамика изменений структуры хроматина на различных стадиях дифференцировки сперматид человека. На всех стадиях дифференцировки, кроме конечных, глобулярно-фибриллярные комплексы представляют собой центры ассоциации элементарных фибрилл. Процесс конденсации хроматина имеет векторный характер – он направлен от апикальной зоны ядра к базальной. В зрелых сперматидах преобладающим компонентом являются фибриллы толщиной около 40 нм. По своей структурной организации ядра зрелых сперматид полностью соответствуют ядрам сперматозоидов с «незрелым» хроматином, которые в небольшом количестве обнаруживаются в эякуляте здоровых доноров и могут преобладать над нормальными клетками при патологиях спермиогенеза.

Методом иммунофлуоресцентного анализа изучены изменения, возникающие в структуре VE-кадгериновых контактов, актинового цитоскелета, системы цитоплазматических микротрубочек в целом, а также отдельно динамичных и стабильных микротрубочек после воздействия аденозина. С помощью специально разработанного метода количественной оценки содержания тубулинов (бета-тубулина, ацетилированного тубулина, тирозилированного тубулина) в примембранном слое эндотелиоцитов проведён анализ изменения количества микротрубочек в районе VE-кадгериновых контактов в клетках, обработанных аденозином.

В отделе математических методов в биологии (и.о. зав. к.ф.-м.н. А.В. Алексеевский) в результате исследований влияния митохондриально-направленных антиоксидантов на опухолевые клетки показано, что эти соединения тормозят деление клеток карциномы шейки матки (разных линий) и карциномы лёгкого, а также блокируют размножение клеток рабдомиосаркомы человека (рук. чл.-корр. РАМН Ю.М. Васильев).

Описан фундаментальный принцип управления фазической гладкой мускулатурой у животных. Показано, что брюхоногие моллюски могут менять скорость локомоции посредством изменения состояния фазической гладкой мускулатуры ноги. Впервые исследованы межклеточные коммуникации через щелевые контакты в процессе репрограммирования соматических клеток в плюрипотентные стволовые клетки, а также в противоположном процессе дифференцировки из плюрипотентного состояния в различные клеточные типы (рук. к.б.н. Г.А. Павлова).

Впервые показано угнетающее действие холестерин-связывающего пептида на фагоцитозную активность макрофагов IC-21. При анализе данных учтена плотность культуры, влияющая на показатели фагоцитоза. Также установлено, что характер поведения митохондрий в верхушках гиф гриба Neurospora crassa в зависимости от скорости роста и ветвления гиф совпадает с поведением микротрубочек (рук. д.б.н. Т.А. Потапова).

 

«Геномика, протеомика. Белковая и генная инженерия. Трансгеноз, генотерапия. Молекулярная медицина»

В отделе химии нуклеиновых кислот (зав. д.х.н. Т.С. Орецкая) с целью изучения каталитической активности интегразы ВИЧ-1 и поиска её ингибиторов разработан новый высокоэффективный метод, основанный на изменении интенсивности флуоресценции флуоресцеин-меченого субстрата интегразы при его взаимодействии с ферментом, что позволяет успешно использовать метод для создания новых ингибиторов ИН.

Открыты новые возможности для структурно-функциональных исследований различных промежуточных комплексов MutS с ДНК. Динамичные структуры, образуемые белком MutS, были зафиксированы на ДНК с использованием мутантных форм MutS, содержащих единичный остаток цистеина в заданном положении, а также модифицированные ДНК-фрагменты с 3’-концевыми дитиогруппами.

В отделе химии и биохимии нуклеопротеидов (зав. д.х.н. А.Б. Вартапетян) показано, что апоптотическая протеаза растений фитаспаза способна in vitro осуществлять процессинг белка просистемина с образованием защитного пептидного гормона растений системина.

Cоздана модель взаимодействия растения и патогенной бактерии, предполагающая конкуренцию на уровне межклеточного и ядерно-цитоплазматического транспорта между макромолекулами хозяина и вирулентными факторами бактериального патогена.

Доказано, что для активации опухолевого супрессора р53 существенно нарушение биосинтеза фосфолипидов, вызванное ингибированием III комплекса дыхательной цепи митохондрий.

Методом иммунопреципитации хроматина показано, что протимозин альфа стимулирует р53-зависимую транскрипцию путём разрушения репрессорного комплекса р53-гистон Н1.

Разработан метод определения активности танкиразы, фермента семейства PARP, катализирующего поли-ADP-рибозилирование, в печени подопытных мышей.

В отделе молекулярных основ онтогенеза (зав. чл.-корр. РАН Б.Ф. Ванюшин) открыт новый механизм сопряжённой регуляции (SAM) активности эукариотических (растительных) ферментов – эндонуклеаз.

Разработан метод диагностики мужской инфертильности у человека, основанный на количественном определении уровня упаковки хроматина при дифферецировке.

Проведено исследование гепатопротекторного и гиполипедемического действия препарата инцистерола (получен патент в 2011 г.) на лабораторных животных. Разработан метод синтеза инцистерола (получен патент в 2012 г.).

В отделе сигнальных систем клетки (зав. д.б.н. П.П. Филиппов) одним из основных научных направлений является исследование молекулярных механизмов рака. Впервые показано, что в условиях интенсивного светового облучения сетчатки глаза рековерин, относящийся к семейству нейрональных кальциевых сенсоров, может образовывать димер, в котором мономеры соединены межмолекулярной дисульфидной связью, которая образована вследствие окисления остатков цистеина-39, присутствующих в мономерах этого белка. Предложен механизм функционирования рековерина в условиях окислительного стресса, индуцируемого световым облучением высокой интенсивности. Продемонстрирован неожиданный факт способности свободной от кальция формы другого нейронального кальциевого сенсора GCAP2 (guanylate cyclase activating protein 2) регулировать родопсинкиназу подобно рековерину. Тем самым обнаружен новый механизм Са²⁺-зависимой регуляции фосфорилирования зрительного рецептора родопсина, катализируемого родопсинкиназой. Предложена новая концепция комплексной регуляции процесса десенситизации родопсина под действием нейрональных Са²⁺-сенсоров рековерина и GCAP2 в условиях изменения концентрации кальция в фоторецепторной клетке.

На примере одного из раково-сетчаточных антигенов – гуанилилциклазы 1 (GC1) показано, что его аберрантная экспрессия, которая в норме ограничена сетчаткой глаза, важна для биологии клеток карциномы поджелудочной железы и, возможно, и других злокачественных опухолей. Фермент оказался вовлечённым в метаболизм cGMP и гомеостаз ионов кальция, а выключение гена GC1 изменяет выживаемость, пролиферацию, радиочувствительность, миграцию и инвазивность трансформированных клеток.

В отделе эволюционной биохимии (зав. д.б.н. А.В. Троицкий) продолжены исследования по молекулярной филогенетике различных групп животных и растений. Полученные в ходе исследований новые нуклеотидные последовательности внесены в международную базу данных GenBank. В ряде случаев проведено соотнесение морфологических признаков с молекулярно-филогенетическими деревьями, осуществлены переоценки значимости отдельных морфологических признаков как критериев родства и ревизии систематики групп.

По различным ДНК-маркерам реконструирована филогения и установлены генеалогические связи у представителей ряда групп эукариот. У растений – мхов Hypnales, печеночников Cephaloziineae (Jungermanniales), двудольных Umbelliferae, Hydatellaceae (Nymphaeales), Polygonaceae, родов Lotus и Anthyllis (Loteae, Leguminosae). У простейших и животных – архегрегарины Selenidium sp. (Apicomplexa), внеклеточных паразитов полихеты Pygospio elegans, эндопаразитов водорослей Amoeboaphelidium protococcarum (Aphelidea), иглокожих отряда Holasteroida (Echinoidea), морских ежей родов Gracilechinus и Echinu, брахиопод. Молекулярно-генетическими методами изучена структура популяций мальмы (Salvelinus, Salmonidae), среднеазиатских термитов, печеночников Hygrobiella и Barbilophozia, елей Picea abies и P. оbovata.

В отделе иммунологии (зав. чл.-корр. РАН С.А. Недоспасов) были изучены специфические функции цитокина – фактора некроза опухолей (ФНО), продуцируемого миелоидными клетками и лимфоцитами, в патогенезе экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЭАЭ) – мышиной модели рассеянного склероза. Используя панель мышей с тканеспецифической инактивацией гена ФНО, было установлено, что данный цитокин, вырабатываемый миелоидными клетками, вызывает начальную фазу заболевания, а продуцируемый Т-клетками участвует после этого в повреждении ЦНС. Частичная или полная блокировка ФНО приводит к существенным иммунорегуляторным эффектам на развитие аутореактивных Тh1 и Тh17 клеток. Последнее обстоятельство и может быть причиной неэффективности терапии рассеянного склероза, основанной на системной блокировке ФНО. Получено и охарактеризовано новое биспецифическое антитело, блокирующее ФНО человека, синтезируемое мышиными макрофагами. Данное биспецифическое антитело представляет собой прототип для создания линейки специфических блокаторов ФНО, ингибирующих действие данного цитокина в зависимости от его клеточного источника.

 

«Математические модели в биологии»

В отделе математических методов в биологии (и.о. зав. к.ф.-м.н. А.В. Алексеевский) разработан веб-сервис SheeP по детектированию бета-листов в структурах белков не имеющий аналогов. На основе алгоритма и программы SheeP разработана и тестируется бета-версия программы и веб-сервиса ArchiP, детектирующих архитектуру белковой молекуле во входном файле с пространственной структурой белка. Алгоритмически решена проблема выделения основных структурных единиц, составляющих ядро белка, и минорных единиц, не играющих решающей роли в укладке полипептидной цепи.

Разработана новая версия компьютерной базы ДНК-белковых и РНК-белковых комплексов NPIDB. База снабжена дружественным веб-интерфейсом и открыта для бесплатного использования через Интернет.

Методами сравнительной геномики предсказано существование нового типа организации систем рестрикции-модификации, названных «рассредоточенными». Ранее была описана лишь одна рассредоточенная система рестрикции модификации в трёх штаммах Staphylococcus aureus. Методами сравнительной геномики идентифицировано несколько десятков таких систем.

Получил развитие новый подход к совместному описанию геномов близкородственных прокариотических организмов. Предлагаемое алгоритмическое описание геномов названо нуклеотидным пан-геномом. Аналогичный подход развивается для улучшения сборки и аннотации генома организма, имеющего существенно различающиеся по последовательности гаплотипы (порядка 10% несовпадающих нуклеотидов). Разработана методика и проведено сравнение методов реконструкции молекулярной филогении. Создана программа Nhunt для поиска по сходству в нуклеотидных базах данных. На ряде примеров Nhunt превосходит по чувствительности и специфичности широко используемую программу BLASTn.

В области теоретической математики получена явная формула для функции распределения собственных значений оператора Лапласа на компактной римановой поверхности рода больше единицы. Развита теория обобщённых чисел Гурвица и связанных с ними алгебр дифференциальных операторов на бесконечномерный случай.

Продолжено изучение методами структурной организации данных здоровье женщин в пери- и постменопаузе на основе сбора клинических данных совместно с акушерами-гинекологами МОНИАГ. Показано, что препараты фемостон 2/10 и фемостон 1/5 эффективны в отношении влияния на минеральную плотность костной ткани (МПКТ) позвоночника, эффективность зависит от количества эстрадиола в препарате и в периферической крови, от исходной МПКТ – при большем снижении её происходит более выраженное увеличение на фоне заместительной гормонотерапии. Фемостон 2/10 предотвращает увеличение массы тела, окружности талии у женщин в постменопаузе.

 

Учебная работа

Институт готовит высококвалифицированных специалистов в наиболее важных областях биохимии, молекулярной и клеточной биологии, вирусологии, биофизики, биоорганической химии, биоинженерии, биоинформатики и молекулярной медицины. В лабораториях института выполняют курсовые, дипломные и кандидатские работы студенты и аспиранты ряда кафедр биологического, химического, физического факультетов МГУ и других учебных заведений Москвы.

Сотрудники создали и читают на трёх факультетах 35 оригинальных общих и специальных, обязательных курсов. Ими организованно и проводится 20 обязательных студенческих спецпрактикумов, а также семинаров для студентов факультета биоинженерии и биоинформатики в соответствии с учебным планом. Каждый студент младших курсов факультета биоинженерии и биоинформатики находится под патронажем научных сотрудников института. Под руководством учёных института в 2012 г. было защищено 3 кандидатских диссертаций аспирантами факультета биоинженерии и биоинформатики.

30 июня 2012 г. официально закрылась образовательная Программа «Онкоиммунология» (дир. чл.-корр. РАН С.А.Недоспасов), работавшая в течение 12 лет. Программа была осуществлена благодаря спонсорской поддержке Института раковых исследований в Нью-Йорке (Cancer Research Institute). За это время прочитано около 100 тематических миникурсов и около 50 специальных лекций. Среди лекторов – 13 российских и 80 зарубежных учёных, в т.ч. 8 лауреатов Нобелевской премии, более 50 членов национальных академий (России, США и Великобритании). Предполагается и в дальнейшем продолжать поддерживать сайт и архив Программы «Онкоиммунология».

МГУ – школе. Всё больший интерес и популярность приобретает программа «Развитие форм и методов исследования природы вместе с детьми. Уроки для будущего» (рук. вед.н.с. Т.В. Потапова). С 2009 г. по 2012 г – Т.В. Потапова осуществляла научное руководство городской экспериментальной площадкой по теме «Детский сад – эталон экологической культуры» на базе д/с №1820 ЗАО г. Москвы. По завершении эксперимента в 2012 г. был подписан договор о сотрудничестве по программе «МГУ – Школе». С 1 нояб. 2012 г. на факультете биоинженерии и биоинформатики открыта программа краткосрочного повышения квалификации (72 ч.) «Исследование природы вместе с детьми». Программа реализуется в форме дистанционного обучения через сайт «Учёные – детям» (http://kids.genebee.msu.ru). В 2012 г. прошли обучение по этой программе и получили удостоверения государственного образца 30 человек.

 

Доктора и кандидаты наук 2012 г.

Сотрудниками защищена 1 докторская и 5 кандидатских диссертаций.

Диссертация на соискание степени доктора биологических наук защищена ст.н.с. отдела биоэнергетики Cилецким Сергеем Алексеевичем «Молекулярный механизм генерации мембранного потенциала цитохром с оксидазой» Получены новые важные результаты о каталитическом цикле цитохромоксидазы, ключевого фермента энергетического метаболизма аэробных организмов. Детально изучены с временным разрешением индивидуальные стадии электрогенной транслокации электронов и протонов в каталитическом цикле цитохромоксидазы митохондрий и бактерии Rhodobacter sphaeroides. Впервые показано, что в каталитическом цикле цитохромоксидазы митохондрий стадии переноса на кислород 3-го и 4-го электронов (переходы P®F и F®O, соответственно) сопряжены с электрогенным переносом через мембрану равного количества зарядов. Доказано участие ряда консервативных аминокислотных остатков в протон-проводящих структурах, «каналах» D и К, в проведении протонов из внутренней водной фазы в биядерный каталитический центр цитохромоксидазы, а также на внешнюю сторону мембраны. Раскрыта роль «каналов» D и К в переносе протонов на индивидуальных стадиях каталитического цикла цитохромоксидазы. Предложен механизм организации кинетически разрешаемых стадий электрогенной транслокации протонов в одноэлектронных переходах окислительной фазы каталитического цикла цитохромоксидазы. Изучен с микросекундным временным разрешением каталитический цикл представителя семейства Б гем-медных терминальных оксидаз, цитохромоксидазы bа₃ из Thermus thermophilus. Предложена схема реакции полностью восстановленного цитохрома ba₃ с кислородом, раскрывающая причину сниженной эффективности протонного насоса гем-медных оксидаз семейства Б. Обнаружено, что каталитический центр окисленной формы цитохрома ba₃ из Thermus thermophilus, неактивный в реакции связывания внешних лигандов, переходит в активную форму при восстановлении никзоспинового гема b.

Степень кандидата наук присвоена: мл.н.с. отдела электронной микроскопии Арифулину Евгению Альбертовичу («Структурная организация нуклеопротаминового хроматина в сперматозоидах человека»); мл.н.с. отдела электронной микроскопии Мусиновой Яне Рафаэловне («Механизм накопления белков в ядрышке»); инж. отдела биокинетики Ушакову Геннадию Александровичу («Термодинамические и кинетические особенности ацилирования аминосоединений в водной среде, катализируемого пенициллинацилазой»); мл.н.с отдела биокинетики Халиуллину Илье Галиевичу («Применение методов теоретической химии для изучения механизма действия D-аминопептидазы из Ochrobactrum anthropi, апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазы человека 1 и выбора среды проведения ферментативной реакции»); инж. отдела химии и биохимии нуклеопротеидов Хуторненко Анастасии Александровне («Активация опухолевого супрессора р53 при ингибировании III комплекса дыхательной цепи митохондрий»).

 

Персоналии

Звания «Заслуженный научный сотрудник Московского университета» удостоены вед.н.с. отдела биохимии вирусов растений д.б.н., учёный секретарь экспертного совета Н.О. Калинина и ст.н.с. отдела математических методов в биологии к.м.н. В.И. Самойлов.

Звания «Заслуженный работник Московского университета» удостоены начальник оптико-механического участка Н.С. Горшков и газосварщик В.Д. Федотов.

Премии Европейской Академии наук для молодых учёных удостоены сотрудники отдела отд. химии и биохимии нуклеопротеидов: н.с. Д.Е. Андреев за работу «Глицил тРНК синтетатза специфически связывается с сайтом внутренней посадки рибосомы полиовируса и активирует его трансляцию», ст.н.с. С.Е. Дмитриев за работу «Механизмы доставки тРНК на рибосому и выбора AUG-кодона при инциации трансляции» и н.с. Т.В. Комарова за работу «Фундаментальные и биотехнологические аспекты взаимодействия растения и патогенна».

 

Конференции

170 сотрудников приняли участие в работе научных конференций, симпозиумов и съездов (в т.ч., 36 российских и 32 международных), где было сделано 157 докладов.

В 2012 г. институт принял участие в организации двух международных научных конференций:

– III московская международная конференция «Молекулярная филогенетика MolPhy-3» (31 июля – 4 авг., http://www.molphy.ru). Цель конференции – освещение современного состояния исследований в области молекулярной филогенетики и филогеномики и разработки методов вычислительного анализа молекулярно-эволюционных данных. Были представлены результаты молекулярно-филогенетических исследований различных групп живых организмов с обсуждением их значения для создания естественных систем и изучения биоразнообразия.

– молодёжная международная школа «Вычислительная филоинформатика» (Computational Phyloinformatics). Эти школы организуются ежегодно при участии Национального центра эволюционных исследований США (National Evolutionary Synthesis Center, www.nescent.org) в разных научных центрах мира с привлечением ведущих специалистов в качестве преподавателей. Программа школы включала лекции и практические занятия в компьютерном классе по использованию инструментов Perl,. BioPerl, BioPhylo, BioRuby и основам практики создания баз данных.

 

Публикации

Опубликовано 208 научных статей в отечественных (87) и зарубежных журналах (121), 140 тезис докладов, главы в 6 сборниках статей.

 

Сайт института