МГУ–2015: Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского

Юбилеи. В 2015 г. Научно-исследовательскому институту физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского исполнилось 50 лет. Физико-химическая биология возникла на рубеже 1950–1960-х гг. как комплекс наук, изучающих жизненные процессы на молекулярном уровне. Она объединила в себе молекулярную биологию, молекулярную генетику, молекулярную вирусологию, многие разделы биохимии, биофизики, биоорганической химии и клеточной биологии. Научно-исследовательский институт физико-химической биологии МГУ был создан усилиями выдающихся учёных – А.Н. Белозерского, И.М. Гельфанда, С.Е. Северина и М.А. Прокофьева. Начиналось всё с двух межфакультетских лабораторий – биоорганической химии и математических методов в биологии, которые в 1965 г. заработали в новом лабораторном корпусе «А». В то же время сложилось ядро коллектива института, сформировались основные направления научной работы. За эти годы сотрудники добились выдающихся успехов в области биоэнергетики, энзимологии, эволюционной биохимии, геномики, химии и биохимии нуклеиновых кислот, молекулярной вирусологии, клеточной биологии, в развитии физических и математических методов исследования биологических объектов. В институте сформировались устойчивые научные школы. НИИФХБ провёл международную конференцию «Физико-химическая биология: из века XX в век XXI» (19–21 января 2016 г.). В программу вошли доклады по важным вопросам современной биологии, химии, медицины. Директор НИИФХБ В.П.Скулачёв выступил с докладом «Институту физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского – 50 лет: историческое эссе».

 

Общие сведения. Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского был основан в 1965 г. как межфакультетская проблемная лаборатория биоорганической химии. Современное название имеет с 1991 г. С 1972 г. пост директора занимает акад. РАН В.П. Скулачёв; зам. директора по научной работе – акад. РАН А.А. Богданов, зам. директора по общим вопросам – к.э.н. Д.А. Матвеев.

Среди сотрудников института 20 человек являются членами 34 зарубежных научных сообществ. Работает национальный российский узел ENBnet Европейской организации по биокомпьютингу, обеспечивающий биологов и медиков России телекоммуникационным доступом к анализу структурных баз данных.

 

Наука. Проводилась работа по 12 международным проектам и грантам. Ведутся работы по двусторонним рабочим программам с 16 организациями-партнёрами. В 2015 г. работа сотрудников была поддержана 106 грантами РФФИ, 16 грантами РНФ и 2 грантами Президента РФ. Завершены работы по 32 инновационным проектам и 8 проектам для молодых специалистов, поддержанных грантами РФФИ.

Проводилась работа по 12 международным проектам и грантам. Выполняются работы по двусторонним рабочим программам с 25 организациями-партнёрами, в т.ч. с рядом университетов и ведущих научно-исследовательских институтов США, Канады, Австрии, Германии, Франции, Италии, Швеции, Финляндии, Швейцарии, Дании, Нидерландов, Ирландии, Литвы, Тайваня, Узбекистана, Украины и Беларуси. Продолжаются исследования в рамках Программы ВОЗ глобального искоренения полиомиелита, в т.ч. функционирует Региональная референсная лаборатория ВОЗ по мониторингу полиомиелита.

Научно-исследовательская работа велась по 23 госбюджетным темам, относящимся к пяти приоритетным научным направлениям, утверждённым Учёным советом 22 декабря 2014 г.:

1. Структура и функции биологических макромолекул и макромолекулярных комплексов. Биокатализ.

2. Структура и функция биологических мембран. Биоэнергетика. Фотосинтез.

3. Структура и функционирование клетки. Межклеточные взаимодействия. Молекулярные механизмы клеточной дифференцировки, иммунитета и онкогенеза. Взаимодействие вирус-клетка.

4. Геномика, протеомика. Белковая и генная инженерия. Трансгеноз, генотерапия. Молекулярная медицина.

5. Математические модели в биологии.

 

 

В отделе биокинетики (зав. д.х.н. В. Швядас) получены принципиально важные научные результаты. Показано, что введение животным тиамина модулирует активность ряда ферментов, связанных с деградацией аминокислот в цикле Кребса. Исследованы молекулярные механизмы повреждений и защитного действия тиамина при травме мозга. Получены данные, свидетельствующие о корреляции между степенью восстановления после травмы и активностями в мозге ТДФ-зависимой дегидрогеназы 2-оксоадипата и ферментов метаболизма глутамата (глутаминсинтазы и глутаматдегидрогеназы). Обнаружена тиамин-зависимая регуляция обратной корреляции изменений глутаматдегидрогеназы и малик-фермента при травме мозга. В отсутствие тиамина глутаматдегидрогеназа коры мозга при травме падает, а маликфермент растёт, тогда как в присутствии тиамина наблюдали противоположные изменения этих ферментов. Увеличение окисления глутамата за счёт активации тиамином глутаматдегидрогеназы и 2-оксоглутаратдегидрогеназы может защищать от глутаматной нейротоксичности, обеспечивая наблюдаемое после введения тиамина улучшение реабилитации при травме мозга.

 

Одним из основных научных направлений в отделе биохимии животной клетки (зав. проф. В.И. Муронец) является исследование амилоидогенной трансформации белков и некоторых ферментов, связанных с развитием нейродегенеративных заболеваний. Для выявления новых механизмов, участвующих в индукции и развитии болезни Паркинсона, с помощью биоинформатических методов был проведён анализ экспрессии глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (ГАФД) при различных нейродегенеративных заболеваниях. Было показано, что при болезнях Альцгеймера и Гентингтона экспрессия ГАФД в мозге снижается, а при болезни Паркинсона – остаётся неизменной. Возможно, что при болезни Паркинсона снижение экспрессии ГАФД в повреждённых тканях компенсируется её повышением при индукции апоптоза. Для анализа взаимодействия глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы c альфа-синуклеином было выделено три формы этого белка: с гистидиновым тэгом, без тэга и с заменой 136 тирозинового остатка на остаток цистеина. Мутантная форма синуклеина с цистеиновым остатком склонна к димеризации и влияет на агрегацию и амилоидную трансформацию разных форм синуклеина. Продемонстрировано связывание альфа-синуклеина с окисленной формой глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, а также с прионным белком – методом плазмонного резонанса. Показано, что ингибитор ГАФД – гидрохлорид 2-амино-4,7-диметил-6-гидроксибензотиазол – стимулирует диссоциацию комплекса этого белка с синуклеином. Таким образом, были обнаружены соединения, пригодные для разработки новых средств профилактики и лечения болезни Паркинсона.

 

В отделе белков растений (зав. д.б.н. М.А. Белозерский) продолжены исследования пищеварительных пептидаз личинок жуков-вредителей запасов зерновых и продуктов их переработки, Tribolium castaneum и Tenebrio molitor. Проведено сравнение уровней экспрессии цистеиновых катепсинов в кишечнике T. castaneum на разных стадиях развития: в яйце, личинках, куколках и имаго. Сопоставление данных по анализу транскриптома, филогенетических взаимосвязей, ингибиторного анализа с другими публичными данными позволило выявить ключевые цистеиновые пептидазы, которые Т. castaneum использует для переваривания пищи и, следовательно, новые потенциальные цели для биологического контроля этого вредителя.

 

Сотрудниками отдела химии белка (зав. д.х.н. А.А. Байков) открыто новое семейство Н⁺-транспортирующих мембраннных пирофосфатаз, которые частично унаследовали механизм регуляции ионами Na⁺ и K⁺ от предшественника – Na⁺-транспортирующей РРазы. Эти переносчики имеют полный набор из 12 полярных остатков, контактирующих с субстратом, нуклеофильной молекулой воды и 5 ионами магния в канонических мембранных пирофосфатазах, и содержат остаток лизина, определяющий зависимость фермента от ионов К⁺. Два новых белка (из Chlorobium limicola и Cellulomonas fimi) были экспрессированы в Escherichia coli и показали электрогенный транспорт Н⁺, но не Na⁺ в обращённых мембранных везикулах. Уникальные особенности новых пирофосфатаз включают ингибирование ионами Na⁺ и К⁺. Показано, что ионы щелочных металлов замещают ионы Mg²⁺ в комплексе с ферментом, делая невозможным гидролиз субстрата.

Метод малоуглового рентгеновского рассеяния был использован для характеристики бинарных комплексов в системе пирофосфатаза (РРаза)/фруктозо-1,6-бисфосфатальдолаза (FbaB) / глутаматдегидрогеназа (GadA)/5-кето-4-дезоксиуронатизомераза (KduI) из E. сoli. Впервые обнаружено, что РРаза образует комплекс с FbaB с константой диссоциации 2 мкМ и активирует её до 10 раз за счёт снижения константы Михаэлиса от 18 до 2 мМ. GadA также существенно активирует FbaB, однако данный эффект определяется увеличением максимальной скорости. Показано, что все белки-партнёры активируют KduI, увеличивая максимальную скорость на порядок. Обнаружено, что ферментативную активность проявляет мономерная форма KduI, в то время как превалирующие в физиологических условиях димер и гексамер неактивны. К настоящему времени обработаны наборы, снятые для индивидуальных белков, и показано, что кривые рассеяния РРазы, GadA и KduI соответствуют кристаллическим структурам, а FbaB ‒ предложенной сотрудниками отдела теоретической модели.

 

В отделе структуры и функции рибонуклеиновых кислот (зав. чл.-корр. РАН О.А. Донцова) активно ведутся работы по изучению теломеразы – особого вида обратной транскриптазы, активация которой в раковых клетках обеспечивает неконтролируемое деление и рост опухоли. Это делает теломеразу одной из наиболее перспективных мишеней для разработки антираковых препаратов, а создание структурной модели каталитической субъединицы теломеразы, TERT, необходимо для понимания функционирования белка и направленного дизайна ингибиторов теломеразной активности. Для ранее полученного структурного фрагмента TERT H. polymorpha, соответствующего N-концевому домену (TEN, остатки 1‒153), определена кристаллическая структура (разрешение 2,2 ангстрем). Идентифицирована вторичная структура этого белка в растворе, и определены структурные элементы, которые могут быть вовлечены во взаимодействие с белковыми партнёрами TEN. Биоинформатический анализ TERT H. polymorpha позволил определить дополнительные участки, которые могут соответствовать стабильным белковым продуктам. Получены и экспрессированы плазмидные конструкции 11 отобранных фрагментов TERT. Физико-химическая характеристика экспрессировавшихся в растворимом виде 2-х белков позволяет использовать их для дальнейших структурных исследований.

Проведены исследования по выявлению структурных особенностей и функциональной роли двух семейств малых нкРНК: 6S РНК и TRAR РНК, участвующих, соответственно, в процессах транскрипции и трансляции. Определена вторичная структура 6S-2 РНК из B. subtilis и G. Kaustophilus, и выявлены изменения конформации молекул в комплексах с пРНК. Методами обратной транскрипции и ПЦР выяснена природа дополнительного транскрипта, соответствующего каждой из 6S РНК G. kaustophilus и G. stearothermophilus. Определена первичная структура образующихся de novo пРНК с каждой из 6S РНК.

Продолжено комплексное исследование того, как различные модификации рРНК бактерий влияют на биосинтез белка в бактериальной клетке.

 

В лаборатории регуляции синтеза белка (зав. д.х.н. И.Н. Шатский) усовершенствован метод рибосомного профайлинга и с его помощью идентифицированы мРНК, трансляция которых стимулируется наличием в клетках фактора Death Associated Protein 5 (DAP5). Идентифицированы 23 мРНК из клеток 293Т, трансляция которых падает при нокдауне белка DAP5 с помощью РНК-интерференции. Получен активный рекомбинантный белок DAP5 (eIF4G2) и определено его влияние на разные мРНК в бесклеточной системе из асцитных клеток. В рамках проекта по изучению белковых факторов, участвующих в выборе стартового кодона при инициации трансляции у эукариот в норме и при клеточном стрессе, завершено исследование феномена релокализации белка eIF2D на центросому в клетках млекопитающих в условиях окислительного стресса.

 

Научные исследования в отделе химии нуклеиновых кислот (зав. д.х.н. Т.С. Орецкая) проводятся в рамках разработки новых ингибиторов репликации вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) и изучения молекулярных и структурных особенностей взаимодействия интегразы вирусной (ИН) и клеточного белка Ku70. Установлено, что Ku70 связывается с ИН ВИЧ-1, причем это взаимодействие специфично. Предполагается, что взаимодействие Ku70 с ИН важно для эффективной репликации ВИЧ-1, поэтому комплекс этого клеточного белка с вирусной ИН может рассматриваться в качестве новой мишени для создания противовирусных препаратов.

На примере никующей эндонуклеазы BspD6I разработан подход, позволяющий регулировать активность фермента в заданный момент времени с помощью внешнего сигнала (изменение температуры) за счёт использования термочувствительных аналогов субстрата. Сконструированы 13- и 15-звенные немодифицированные синтетические ДНК-дуплексы, которые блокируют активность фермента при 20°С. Повышение температуры вызывает диссоциацию дуплексов-ингибиторов и приводит к восстановлению ферментативной активности. Предлагаемый подход может быть использован для оптимизации реакции изотермической амплификации ДНК с вытеснением цепи, а также для модулирования активности химерных нуклеаз, применяемых в генной терапии.

 

 

В отделе биоэнергетики (зав. акад. РАН В.П. Скулачёв) завершена работа по изучению действия митохондриально-направленного антиоксиданта SkQ1 у старых мышей. Показано, что длительный приём SkQ1 ускоряет заживление полнослойных кожных ран. Обнаружено, что ускоряется как разрешение воспалительной фазы, так и регенеративные процессы. SkQ1 ускоряет формирование грануляционной ткани, стимулируя накопление в ней миофибробластов и неоангиогенез. Кроме того, под действием SkQ1 фибробласты секретируют факторы, стимулирующие подвижность клеток эндотелия, и это, по-видимому, определяет стимуляцию ангиогенеза. Показано, что противовоспалительное действие SkQ1 направлено как на иммунные клетки, так и на клетки эндотелия. Изучение механизмов действия SkQ1 на эти типы клеток продолжается.

На модели экспериментального инсульта у животных была исследована эффективность нового класса веществ, основанного на антиоксидантах растительного происхождения, тимохиноне и пластохиноне. Эти соединения с помощью объединения с катионами родамина или трифенилфосфония были адресованы в митохондрии нейронов. Было показано, что наибольшей эффективностью обладал пластохинон, химически соединенный с родамином, что обеспечивает эффективное проникновение и многократное накопление в митохондриях клеток мозга. Это соединение обладает нейропротекторным действием, уменьшает повреждения мозговой ткани и восстанавливает неврологические функции после инсульта. При этом действие препарата проявлялось при введении как в кровь животным, так и при введении в нос, что может являться более удобным для терапевтического применения. При длительном лечении после инсульта в течение 7 дней у животных восстанавливались функции конечностей, нарушенные при ишемии одного полушария мозга. Таким образом, была доказана терапевтическая эффективность 10-(6’-пластохинонил)деципродамина-19, и он может быть рекомендован для клинических испытаний.

Одним из способов регуляции уровня активных форм кислорода является умеренное разобщение окислительного фосфорилирования при сохранении АТФ-синтазной активности на необходимом для функционирования клетки уровне. Специфическое мечение митохондрий умеренным разобщителем позволило выявить белок, связывающий этот разобщитель, предположительно отвечающий за умеренное разобщение и, соответственно, за защиту митохондрий, клетки и органа от повреждения.

Количественно охарактеризован ингибирующий эффект ионов Ca²⁺, участвующих в регуляции многих метаболических процессов в клетке, на активность цитохромоксидазы в условиях, приближенных к физиологическим. Установлено, что покоящаяся клетка защищена ионами Na⁺ от ингибирующего действия ионов Ca²⁺ , которое, однако, может вступить в игру на пике выброса Ca²⁺ эндоплазматическим ретикулумом.

 

Одно из основных научных направлений в отделе молекулярной энергетики микроорганизмов (зав. д.б.н. А.В. Богачёв) – функционирование электрон-транспортных цепей. Проведено исследование генерации натриевого потенциала родопсином из морской флавобактерии Dokdonia sp. PRO95. Ион-транслоцирующие свойства данного белка были исследованы регистрацией светоиндуцированного трансмембранного транспорта протонов. Показано, что в натрий-содержащих средах этот родопсин осуществляет электрогенный транспорт ионов Na⁺. В отсутствие ионов натрия этот родопсин способен использовать протон в качестве помпируемого иона. Также был измерен светоиндуцированный транспорт Na⁺. Показано, что освещение суспензии клеток, содержащих изучаемый родопсин, приводило к уменьшению цитоплазматической концентрации ионов натрия. Данный процесс ускорялся в присутствии протонофоров. Совокупность полученных данных позволяет заключить, что родопсин из Dokdonia sp. PRO95 функционирует в качестве первичной натриевой помпы.

 

В лаборатории структуры и функции светособирающих антенн (зав. д.ф.-м.н. З.Г. Фетисова) – в соответствии с выдвинутой концепцией жёсткой оптимизации структуры фотосинтезирующего аппарата по функциональному критерию – рассмотрены пути оптимизации структуры неоднородных суперантенн фотосинтезирующих зелёных бактерий, состоящих из нескольких однородных субантенн. В цикле теоретических исследований, использующих математическое моделирование функционирования природных суперантенн, определялись конкретные способы оптимизации этого процесса, состоящие в оптимальном сопряжении структурно-функциональных параметров соседних субантенн, что приводит к устойчивой минимизации времени переноса энергии между ними, т.е. обеспечивает высокую эффективность и стабильность функционирования всей суперантенны в целом. В цикле экспериментальных исследований осуществлялся целенаправленный поиск в природных суперантеннах тех её структурных параметров, которые были предсказаны теоретически для оптимальных модельных систем. В частности, осуществлён поиск конкретных способов оптимального сопряжения субантенн в суперантенне фотосинтезирующих зелёных бактерий C. aurantiacus: хлоросомной БХл с-субантенны Б740, БХл а-субантенны Б798, локализованной в базовой пластинке, и мембранной БХл а-субантенны Б808-866, сопряжённой с реакционными центрами. Модельные расчёты показали, что взаимная ориентация векторов дипольных моментов Q_y-переходов молекул соседних субантенн – Б740, Б798 и Б808-866 (среди которых не известна только ориентация диполей Q_y-переходов БХл а-субантенны Б798) – является фактором, принципиально позволяющим оптимизировать структуру модельной суперантенны по функциональному критерию. Расчёты показали, что оптимальное сопряжение однородных субантенн Б740, Б798 и Б808, достигающееся оптимизацией пространственной ориентации диполей Q_y-переходов БХл а Б798, приводящей к устойчивой минимизации времени переноса энергии Б740→Б798→Б808, соответствует теоретической модели одноосной хаотичной ориентации диполей Q_y-переходов мономерного БХл а Б798 вокруг нормали к мембране с фиксированным углом (φ_опт) наклона БХл а-диполей к плоскости мембраны: φ_опт=54±3°. Найденная теоретически модель оптимальной ориентации диполей Q_y-переходов молекул мономерного БХл а субантенны Б798 в суперантенне C. aurantiacus подтверждена экспериментально: анализ дифференциальных анизотропных спектров фотоиндуцированных изменений поглощения Q_y-полосы БХл а субантенны Б798, измеренных с фемтосекундным разрешением в изолированных хлоросомах C. aurantiacus при прямом возбуждении этой полосы поглощения при комнатной температуре, показал, что векторы дипольных моментов Q_y-переходов БХл а Б798, хаотично ориентированные вокруг нормали к мембране, образуют с плоскостью мембраны угол φ≈55°. Полученное экспериментальное значение φ хорошо соответствует теоретически предсказанному оптимальному значению φ_опт, что подтверждает концепцию жёсткой оптимизации структуры фотосинтезирующего аппарата по функциональному критерию.

 

В отделе фотосинтеза и флуоресцентных методов исследований (зав. д.ф.-м.н. А.П. Разживин) продолжены работы по выяснению физических механизмов высокоэффективного преобразования энергии света в процессе фотосинтеза. Проведено моделирование переноса энергии в антенных комплексах LH2 и LHCII и процессов первичного разделения зарядов в реакционных центрах второй фотосистемы (PSII-RC). Показана роль конформационных изменений на делокализацию возбуждений в одиночных комплексах LH2. Показано, что перенос электрона в PSII-RC является когерентным процессом, включающим сложную суперпозицию экситонных и смешанных (экситонно-колебательных) когерентностей. Принципиально важным результатом является демонстрация роли колебательных мод, резонансных с энергетическим зазором между донором электрона и первичным фотопродуктом. Показано, что смешивание электронных уровней с резонансным колебанием является фактором, повышающим эффективность разделения зарядов в PSII-RC.

 

 

В отделе биохимии вирусов растений (зав. акад. РАН И.Г. Атабеков) проведено исследование экспрессии гена одного из трёх белков, отвечающих за транспорт Х-вируса шалота (ХВШ) в растениях, а именно белка ТБГ3. Этот ген может кодировать белок, сходный с белком ТБГ3 потекс- и карлавирусов, и находится в позиции, характерной для гена ТБГ3 других вирусов, но не имеет инициаторного кодона AUG. В модельной системе, основанной на временной экспрессии вирусных генов, методом агроинфильтрации растений конструкциями, полученными с помощью сайт-направленного мутагенеза, показано, что роль инициаторного кодона данного гена выполняет триплет CUG, находящийся в оптимальном контексте и консервативный у всех известных аллексивирусов. С помощью сайт-направленного мутагенеза получен ряд мутантных генов ТБГ2 и ТБГ3 ХВШ, с помощью которых удалось показать, что трансляция гена ТБГ3 происходит на бицистронной РНК генов ТБГ2/ТБГ3 по механизму leaky scanning.

При изучении механизмов транспорта вирусных геномов в клетки растений показано, что первый из трёх транспортных белков гордеивирусов, кодируемых генами тройного блока (ТБГ), взаимодействует in vivo с вирусными РНК, формируя рибонуклеопротеидные (РНП) частицы с неизвестной структурой, предполагаемую невирионную форму вирусного генома для транспорта в растении. Получена характеристика комплексов, образуемых in vitro белком ТБГ1 полулатентного вируса мятлика в отсутствие и в присутствии вирусной РНК. Показано, что белок ТБГ1 способен к мультимеризации и самосборке в протяжённые высокомолекулярные структуры, которые могут быть разобраны до мономеров белка в процессе инкубации с АТФ. При инкубации с вирусной РНК белок ТБГ1 формирует in vitro нитевидные РПН частицы, напоминающие по морфологии и размерам нитевидные вирионы гибких спиральных вирусов растений. Сравнительный анализ физико-химических характеристик белка ТБГ1 и трёх его структурных доменов в присутствии и в отсутствие РНК показал, что внутренний домен белка выполняет главную структурную функцию во взаимодействиях молекул белка ТБГ1 между собой и с РНК, приводящих к сборке вирусоподобных РНП частиц.

 

Научно-методический отдел хроматографического анализа (зав. д.х.н. Л.А. Баратова) активно сотрудничает с сотрудниками других отделов института и сторонних организаций. Проведены исследования особенностей структуры матриксного белка М1 вируса гриппа А, определяющие его полифункциональность на различных этапах жизненного цикла вируса. Проведено pH-зависимое структурное исследование матриксного белка М1 вируса гриппа и его склонность к самоассоциации в растворе и на подложке методами малоуглового рентгеновского рассеяния и атомно-силовой микроскопии. Эксперименты с липидными везикулами, нагруженными белком М1, также продемонстрировали рН-зависимое разрушение везикулярной мембраны вследствие растяжения липидной мембраны до точки разрыва, промотируя тем самым уширение поры слияния для высвобождения частиц РНП. Таким образом, белок М1 формирует матрикс и вирус-подобные частицы без дополнительных партнёров, что важно для дальнейшего анализа иерархии белка М1 в жизненном цикле вируса.

Выявлены особенности, определяющие амфитропные свойства белка М1: амфипатическая природа ά-спиралей и существование холестерин-распознающих доменов на шести амфипатических ά-спиралях. Для подтверждения этих результатов были генерированы мутанты A/WSN/33 штамма вируса гриппа. Полученные результаты объясняют многие черты этого белка, определяющие его укладку в составе вириона, в частности, его амфитропные свойства и рафт/холестерол связывающий потенциал.

 

Ведущим направлением исследований отдела функциональной биохимии биополимеров является характеристика структурно-функциональных свойств цитоскелетных белков эукариотических клеток. Методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) в сочетании с измерениями температурных зависимостей флуоресценции исследовали изменения доменной структуры изолированных головок миозина (субфрагмент 1 миозина, S1), происходящие при формировании стабильных тройных комплексов S1-ADP-Vi, S1-ADP-AlF4- и S1-ADP-BeFx, имитирующих ключевые интермедиаты АТРазной реакции S1 – S1**-ADP-Pi и S1*-ATP. Показано, что в тройных комплексах S1-ADP-Vi, S1-ADP-AlF4- и S1-ADP-BeFx значительно повышается термостабильность не только моторного домена S1, но и регуляторного домена. Эти данные подтверждают высказанную ранее гипотезу о том, что в процессе АTPазной реакции происходит тесное взаимодействие между двумя главными доменами в молекуле S1 – моторным и регуляторным.

 

Сотрудниками отдела взаимодействия вируса с клеткой (зав. чл.-корр. РАН В.И. Агол) в рамках взаимодействия с Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) Региональной референс-лабораторией ВОЗ по полиомиелиту на базе НИИФХБ подтверждено отсутствие циркуляции диких полиовирусов в РФ и СНГ.
Проанализирована природа небольшой вспышки полиомиелита в Доме ребенка г. Бийск в 2010 г., имеющей весьма существенные, если не уникальные, особенности. Полученные данные демонстрируют ряд новых аспектов патогенеза, эпидемиологии и эволюции производных вакцинного штамма полиовируса и указывают на серьёзные пробелы в понимании существующих проблем.

Разработан метод прямого определения энтеровирусов в спинномозговой жидкости пациентов с подозрением на серозный менингит, позволяющий определение вирусной структуры в высоком проценте энтеровирусных заболеваний.

Изучено пространство нуклеотидных последовательностей консервативного цис-элемента РНК-генома вируса полиомиелита, совместимых с жизнеспособностью вируса. Показана чрезвычайная мутационная устойчивость этого элемента. Полученные данные углубляют представления о механизмах, поддерживающих как стабильность, так и способность к эволюции вирусных РНК-геномов.

 

Коллектив отдела электронной микроскопии (зав. д.б.н. И.И. Киреев) проводит научные изыскания в области ультраструктурной организации клетки, а также обучение и сопровождение ультраструктурных исследований сотрудников института.

Исследована динамика разборки интерфазных проядрышек и роли РНК в их формировании. Доказано, что процесс восстановления структуры ядрышка не определяется переносом материала в составе проядрышек. Разборка проядрышек происходит путём постепенного ухода накопленных ядрышковых белков, а движущей силой разборки этих телец является уход созревших рРНК из проядрышек. Показано, что концентрация ядрышковых белков в нуклеоплазме влияет на динамику разборки проядрышек: увеличение концентрации тормозит разборку, а уменьшение – ускоряет.

Изучена ультpаcтpуктуpа пигментного эпителия полевки Бpандта, гpызуна c дневным типом cуточной активноcти, cоотноcительно c извеcтными пpоцеccами, пpоиcxодящими в пигментном эпителии: поcтуплением отделённыx от фотоpецептоpныx мембpан наpужныx cегментов и пеpеваpиванием иx в фагоcомаx пигментного эпителия. В цитоплазме пигментного эпителия полёвки миелоидные тела не были найдены, однако были обнаpужены так называемые ламелляpные включения, котоpые по cвоим pазмеpам отличаютcя от миелоидныx тел.

Проанализированы изменения цитоскелета эндотелиальных клеток от момента распластывания и образования первых межклеточных контактов до формирования конфлюэнтного монослоя. Предварительные данные показывают, что в условиях частичной стабилизации микротрубочек нокодазолом, таксолом или винорельбином происходит пространственная дезорганизация их системы в эндоплазме клеток.

Показано, что жизнеспособность сперматозоидов in vitro зависит от температуры инкубации. Жизнеспособность сперматозоидов повышается при добавлении митохондриально направленного антиоксиданта SkQ1. Исследовано влияние семенной жидкости на жизнеспособность сперматозоидов. Показано, что индукция гибели сперматозоидов является внутренним свойством каждого индивидуального образца.

 

В отделе математических методов в биологии (и.о. зав. к.ф.-м.н. А.В. Алексеевский) одним из важнейших направлений научных исследований является нормализация опухолевых клеток. Исследованы сигнальные пути, связанные с предотвращением эпителиально-мезенхимального перехода. Выявлена ведущая роль митоген-активируемых протеин-киназных сигнальных путей в морфологических и биохимических изменениях клеток цервикальных карцином при нормализующем воздействии митохондриально-направленных антиоксидантов SkQ. Продемонстрировано существование функционально разных актиновых систем, что позволило выявить качественно новые закономерности реорганизации актинового цитоскелета при неопластической трансформации. Впервые показана связь трансформации клетки с процессами реорганизации цитоплазматических изоформ актина и модуляции в их экспрессии. Изменение соотношения изоформ актина характерно для клеток in vitro и для тканевых опухолевых образцов и непосредственно связано с онкогенными свойствами и ростом опухолевых ксенографтов.

Создана экспериментальная модель торможения пролиферации опухолевых клеток под действием митохондриально-направленных антиоксидантов в культуре клеток на примере опухолевых линий сарком и рака простаты человека. Исследованы механизмы эффектов SkQ на индуцируемые TNF воспалительные реакции, радиопротекторного действия митохондриально-направленных антиоксидантов на культурах с различной лекарственной устойчивостью (рук. чл.-корр. РАМН Ю.М.Васильев).

В рамках плановой темы «Роль биологически активных молекул в функционировании клеток и тканей животных и человека» проведена оценка мощности ресничек эпителия на подошве прудовой улитки Lymnaea stagnalis. Ресничные эпителии широко распространены в животном царстве. Несмотря на то, что функционирование ресничек всесторонне исследуется, оценка их мощности затруднена. Установлено, что суммарная мощность ресничек на подошве составляет 1.47.10^-6 Вт, мощность одной реснички ‒ 1.1.10^-15 Вт и одного ресничного биения ‒ 1.1.10^-16 Вт. Полученные данные могут быть использованы при оценке работы морфологически сходных ресничных эпителиев (в т.ч. в дыхательных путях человека), а также при составлении питательных сред для выращивания ресничных эпителиев в ожоговых центрах.

Совместно с лабораторией канцерогенных веществ РОНЦ им. Н.Н.Блохина продолжена работа по изучению роли клеточного микроокружения в опухолевой промоции и прогрессии. Исследовано влияние канцерогенных полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) на проницаемость межклеточных щелевых контактов (МЩК) в трансформированных клетках эмбриональных фибробластов крысы в сравнении с клетками гепатом. Показано, что бенз\а\пирен является универсальным ингибитором МЩК независимо от типа исследованных клеток. Показано снижение проницаемости МЩК до 10% от исходного значения через 1 час и до нуля через 24 часа, тогда как 3-метилхолантрен действует на МЩК фибробластов в 2 раза слабей, чем на клетки гепатом, что может говорить о специфичности промоторного действия ПАУ.

 

 

В отделе химии и биохимии нуклеопротеидов (зав. д.х.н. А.Б. Вартапетян) продолжено исследование апоптотической протеазы растений фитаспазы. Установлено, что повышение уровня фитаспазы в трансгенных томатах усиливает процесс программированной клеточной смерти, а снижение уровня этого фермента, напротив, защищает растительные клетки от гибели, вызванной стрессовыми воздействиями.

В рамках исследования генетических и химических основ коммуникации в растительном сообществе клонирован промотор гена пектинметилэстеразы (PME) табака и исследованы его транс-активирующие свойства. Показано, что хотя промотор PME и менее активен, чем 35S-промотор вируса мозаики цветной капусты, он обеспечивает экспрессию репортёрного гена GUS. Обнаружено, что белок не-клеточно-автономного пути NCAPP подавляет транскрипцию, контролируемую промотором PME. Получены трансгенные, стабильно трансформированные растения табака, содержащие генетическую вставку промотор PME:GUS.

В процессе изучения механизмов функционирования опухолевого супрессора р53 исследовано влияние р53 на индукцию экспрессии мРНК транскрипционного фактора ATF4 и его генов-мишеней ASNS, SLC7A11, TRIB3 при действии ингибитора комплекса I дыхательной цепи митохондрий пирицидина А. Подтверждена гипотеза о том, что активация р53 подавляет экспрессию ATF4 и его генов-мишеней при митохондриальной дисфункции.

Осуществлён рибосомный профайлинг для клеток, находящихся в условиях гипоксии и голодания по глюкозе (имитация ишемии). Серьёзные изменения в экспрессии генов наблюдались после 20-минутной гипоксии-голодания, причём изменения в транскрипции наблюдались всего для 100 генов, а изменения в трансляции затрагивали порядка 3000 генов. Они связаны как с изменениями в скоростях инициации и элонгации синтеза белков, так и в строгости узнавания их инициаторных кодонов. В наибольшей степени изменения затрагивают гены, вовлечённые в окислительное фосфорилирование. Изменения включают трансляцию uORF (upstream open reading frames), сайт-специфические паузы в движении рибосом по матрицам, образование альтернативных изоформ с аминокислотными довесками на N-концах, трансляцию двух белковых продуктов с одного сегмента мРНК, но в двух разных рамках считывания.

 

В отделе молекулярных основ онтогенеза (зав. чл.-корр. РАН Б.Ф. Ванюшин) проведено исследование поведения энергетически независимых доменов хроматина в ядре печени крысы при изменении концентрации поликатионов и антибиотика-пептида дистамицина. Полученные результаты показали влияние этих факторов на высшие уровни упаковки ДНК в ядре. Возможность модуляции структуры хроматина на высших уровнях компактизации ДНК формирует новые модели эпигенетических механизмов.

Продолжена работа по изучению влияния коротких пептидов на экспрессию генов в стареющих клеточных культурах. Показано тканеспецифическое действие пептидов KEDW и AEDL на экспрессию генов и синтез белков в культурах клеток соответственно поджелудочной железы и бронхиального эпителия. Причём с увеличением возраста культуры и под действием пептидов меняется профиль метилирования промоторных участков группы генов, что может быть причиной возрастных и индуцированных пептидами изменений в уровнях их экспрессии.

Продолжено исследование гормон-зависимых эффектов открытого сотрудниками отдела нового производного витамина Д2 – инцистерола (активного начала экстрактов из мицелия вёшенки Pleurotus ostractus). Разработан синтез инцистерола из эргостерола, оптимизированы условия реакции его фотоизомеризации. Ведётся работа по препаративному выделению инцистерола для доклинических и клинических испытаний в качестве фармакологической субстанции при лечении некоторых форм онкологических заболеваний как препарата сопровождения при химиотерапии, а также при лечении гиполипидемии, и как гепатопротекторного препарата.

 

В отделе сигнальных систем клетки (зав. д.б.н. П.П. Филиппов) одним из основных научных направлений является исследование молекулярных механизмов рака. С применением масс-спектрометрии и других подходов в экстрактах облучённых препаратов сетчатки глаза впервые детектированы смешанные дисульфидные формы рековерина и регуляторных субъединиц 26S протеасомы.

Выявлено негативное влияние окислительных модификаций рековерина на его Са²⁺-зависимую регуляторную активность в отношении родопсинкиназы (GRK1).

Установлено, что фоторецепторные Са²⁺-сенсорные белки GCAP1 и GCAP2 в мягких окисляющих условиях способны образовывать димеры/мультимеры, стабилизируемые за счёт межмолекулярных дисульфидных связей.

Исследованы морфологические изменения в глазах и других органах кролика при иммунизации рековерином. Показано, что эти изменения аналогичны морфологической картине хронического аутоиммунного увеоретинита у человека.

 

В отделе эволюционной биохимии (зав. д.б.н. А.В. Троицкий) основной предмет исследований ‒ молекулярная филогенетика различных групп животных и растений. С помощью новой программы NPG-explorer (NPGe) построен нуклеотидный пангеном для митохондриальных геномов 24 видов мхов. Филогенетическое дерево, полученное с помощью этой программы, хорошо соответствует другим филогенетическим реконструкциям. Процессы потери и приобретения участков ДНК в митохондриальных геномах мхов достаточно активны, и такие перестройки, очевидно, могут быть использованы как дополнительные маркеры при реконструкции филогении. Проведено сравнение эффективности в качестве филогенетических маркеров генов 18S и 28S рРНК для видов с повышенной скоростью молекулярной эволюции

Проведён молекулярно-филогенетический анализ 66 представителей гаплолепидных мхов, результаты которого свидетельствуют о полифилетичности семейства Ditrichaceae и 24 гаплоидных генотипов растущего на древесине гриба Schizophyllum commune (12 – из США и 12 – из Европейской России).

Секвенированы и аннотированы полная нуклеотидная последовательность митохондриального генома глубоководного бокоплава Brachyuropus grewingkii из Байкала и пластидного генома голопаразита, Lathraea squamaria. Определены нуклеотидные последовательности генов 18S рРНК и COI 10 видов копепод Карибского бассейна (симбионтов кораллов, губок и иглокожих) и шести видов диатомовых и зеленых водорослей из содовых озер Кулундинской степи, являющихся кандидатами на культивирование на биотопливо.

Продолжены работы по изучению генетической структуры лососевых рыб подотряда Salmonoidea. Основная цель генетических исследований Европейского хариуса является сохранение и рациональная эксплуатация этого вида.

 

Сотрудниками отдела иммунологии (зав. чл.-корр. РАН С.А. Недоспасов) продолжены работы по изучению Толл-подобных рецепторов (TLR) врожденного иммунитета на примере TLR4, который – наряду с защитными функциями (связывание липополисахарида) – играет роль и в поддержании гомеостаза организма и экспрессируется различными типами клеток. Для того чтобы изучить функции TLR4, производимого Т лимфоцитами и миелоидными клетками, были созданы мыши с тканеспецифической делецией TLR4 в этих популяциях клеток с использованием Cre-LoxP технологии. Системная активация TLR4 липополисахаридом приводит к высокой продукции фактора некроза опухолей (TNF) миелоидными клетками и последующему развитию септического шока и смерти. Установлено, что полное удаление TLR4 во всех клетках мутантов приводит к защите от септического шока при его индукции посредством введения LPS/D-Gal. В то же время удаление TNF, но не TLR4, в миелоидных клетках предотвращает развитие патологии. Анализ TNF-продукции в М-TLR4 КО мышах при введении LPS/D-Ga также показал, что делеция TLR4 на миелоидных клетках снижает, но не полностью блокирует продукцию TNF при септическом шоке. Кроме того, была обнаружена критическая роль TLR4, производимого Т-клетками (но не миелоидными клетками) для индукции аутоиммунного колита. Показано, что удаление гена TLR4 в Т-клетках приводит к более тяжёлому протеканию колита, индуцированного добавлением натриевой соли декстрансульфата в питьевую воду. Дальнейший анализ показал, что Т-TLR4 контролирует миграцию воспалительных моноцитов, нейтрофилов и γδ Т-клеток в толстую кишку при колите и тем самым снижает тяжесть течения заболевания.

 

 

В отделе математических методов в биологии (и.о. зав. к.ф.-м.н. В.В. Алексеевский) в базу данных NPIDB добавлены новые возможности анализа структур комплексов белков с нуклеиновыми кислотами.

Разработаны два новых веб-сервиса для сравнительного анализа структур макромолекулярных комплексов: StructAlign – программа для выравнивания структур ДНК-белковых комплексов и новая программа для выявления геометрического ядра набора структур комплексов макромолекул.

Дальнейшее развитие получила программа построения т.н. нуклеотидного пангенома, выпущен новый релиз.

Создана бета-версия веб-сервиса conredet ‒ детектора трёх видов сигналов в фотографиях культуры клеток с помощью конфокального микроскопа.

Проведено теоретическое обобщение проведённого ранее биоинформатического анализа белков, относящихся к содержащим фосфат-связывающую P-петлю НТФазам. Полагают, что поддержание во всех (с важным уточнением ‒ активно работающих, не находящихся в полуанабиозе) клетках соотношения концентраций [K⁺]/[Na⁺] > 1 может быть необходимым для функционирования целого ряда калий-зависимый НТФаз, а система натрий-калиевого гомеостаза клетки могла послужить отправной точкой биоэнергетики.

Усовершенствованы программы анализа трёхмерных структур бета-содержащих белков: MotiS (осуществляет поиск структурных мотивов по формальному описанию), YADD (детектор структурных доменов) и ProTop (программа для построения топологических выравниваний).

В области спектральной геометрии установлена связь между спектром резонансов и дискретным спектром оператора Лапласа связанного с кофинитными группами. Доказано, что распределение простых чисел восстанавливается по дискретному спектру.

 

Учебная работа. Институт является частью единого научно-образовательного комплекса МГУ (институт-факультет) и готовит высококвалифицированных специалистов в наиболее важных областях биохимии, молекулярной и клеточной биологии, вирусологии, биофизики, биоорганической химии, биоинженерии, биоинформатики и молекулярной медицины. В лабораториях института выполняют квалификационные работы студенты и аспиранты ряда кафедр биологического, химического, физического факультетов МГУ и других учебных заведений Москвы. Сотрудники создали и читают оригинальные общие и специальные обязательные курсы, проводят обязательные студенческие спецпрактикумы и семинары для студентов факультета биоинженерии и биоинформатики в соответствии с учебным планом.

Довузовская работа. В 2015 г. институт совместно с факультетом биоинженерии и биоинформатики продолжал работу по реализации специальной образовательной программы «Человек и природа. Первые шаги» (научн. рук. д.б.н. Т.В. Потапова), основная задача которой, состоит в создании благоприятных условий для усвоения детьми основ биосферного мышления. В работе по программе участвовали 18 сотрудников, в т.ч. 16 кандидатов наук, 3 аспиранта и 5 студентов. Проведён конкурс «Человек и Природа. Первые шаги» при поддержке Департамента природопользования и охраны окружающей среды и Департамента образования правительства Москвы. Представлено 27 проектов с участием 326 детей дошкольного возраста и 100 проектов с участием 247 детей младшего школьного возраста.

 

Конференции. 160 сотрудников приняли участие в работе научных конференций, симпозиумов и съездов, в т.ч., в 82 российских и 67 международных, где было сделано 270 докладов.

Организованы и проведены:

‒ II международная конференция «Homo sapiens liberatus», посвящённую 80-летию со дня рождения директора института акад. РАН В.П.Скулачёва (2‒4 марта). Повестка дня касается фундаментальных и прикладных вопросов биологии и медицины, включая разнообразные аспекты биоэнергетики. Проведено 8 секционных заседаний, в т.ч. «Биоэнергетика и биоинформатика», «Активные формы кислорода. Множественность митохондриальных функций», «Биоэнергетика на службе медицины», «Проблемы старения», «Новости с фронта ионов Скулачёва»;

‒ международная конференция по микроскопии с супер-разрешением «Super-resolution in different dimensions» (июнь). В 2015 г. НИИФХБ был признан членом международной сети центров микроскопии «высшего уровня» Nikon Centers of Excellence;

‒ International Moscow Conference on Computational Molecular Biology (MCCMB’15) (16‒19 июля).

 

Доктора и кандидаты наук 2015 г. Степень доктора химических наук присвоена ст.н.с. отдела хроматографического анализа Штыковой Элеоноре Владимировне за диссертацию «Метод малоуглового рентгеновского рассеяния в структурной диагностике надмолекулярных комплексов». Предложены новые подходы к структурным исследованиям полидисперсных, полиморфных и полностью или частично разупорядоченных соединений с помощью малоуглового рентгеновского рассеяния (МУРР), позволяющие эффективно применять этот метод для анализа новейших нанотехнологических материалов. Компьютерное моделирование, позволило определить условия и ограничения использования современных методов интерпретации данных МУРР для структурных исследований сложных наноразмерных систем. Были построены и обобщены структурные модели, отражающие функциональные особенности различных нанокомпозитов, и определена надатомная структура широкого класса супрамолекулярных синтетических и биологических ансамблей. Выявлены закономерности формирования и стабилизации различных неорганических наночастиц (серебра, золота, платины, магнетита, кобальта и др.) в различных носителях, исследованы процессы стабилизации монодисперсных магнитных наночастиц биодеградируемыми полимерами, и показаны особенности их поведения в водных растворах в зависимости от структуры, композиции и толщины стабилизирующего полимерного слоя. Выявлены закономерности формирования квантовых точек CdS в жёсткоцепных дендримерах, исследованы особенности их стабилизации в зависимости от условий синтеза и структуры дендримеров, и определена морфология наноструктуры полученных композитов. Определены пространственные структуры различных биологических объектов в растворе: иммуноглобулинов, каррагинанов, хитозана, нуклеиновых кислот, ряда белков и белковых комплексов, а также выявлены некоторые физиологически значимые структурные особенности связывания белков с дезоксирибонуклеиновыми кислотами.

 

Кандидатские диссертации защитили: н.с. отдела математических методов в биологии Галкин Иван Ильич («Роль митохондриальных активных форм кислорода в регуляции воспалительного ответа эндотелия»); мл.н.с. лаборатории структуры и функции цитоскелета Фокин Артём Игоревич («Изучение молекулярных механизмов организации цитоскелета и регуляции клеточной подвижности протеинкиназой LOSK/SLK»); мл.н.с. группы системной биологии липидов отдела биокинетики Чистяков Дмитрий Викторович («Регуляция ядерных рецепторов PPAR при стимуляции системы врождённого иммунитета в условиях гипергликемии»).

 

Персоналии. Ст.н.с. отдела математических методов в биологии Г.С.Шагиева награждена премией конкурса молодых научных сотрудников МГУ.

 

Публикации. Опубликованы 190 научных статей в отечественных (62 статьи) и зарубежных журналах (128), 1 монография, 3 учебных пособия, 1 учебник, 200 тезисов докладов, главы в 13 сборниках.

 

Адрес официальной страницы: http://www.belozersky.msu.ru